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扫描电子显微镜

Scanning Electron Microscope

 
 
 
 
 

日志

 
 

扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备  

2011-08-29 16:04:11|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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驰奔   编辑

Iolo ap Gwynn

威尔士大学 生物图像实验室
The University of Wales Bioimaging Laboratory

SEM Imaging 扫描电镜图像

扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--

? Information required ? 需要哪些信息?
– Signal types 信号类型
– Resolution ? 分辨率?
? Specimen preparation 样品准备
– Preservation ? 如何保存
– Dehydration ? 如何脱水
– Coating  镀膜
? Microscope settings 电镜参数设置
? Interpretation  图像解释
– Analysis  图像分析

Specimen types (general) 样品类型(通常)
? Biomaterial 生物材料
– Surfaces 表面
– Particles 粒子
– Matrices  基体
? Biological material 生物学材料
– Cells    细胞
– Tissues 组织
? Combined Biological/Material 生物复合材料
– Interfaces  界面

 动物样品显微镜观察制备流程

扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--
动物样品扫描电镜观察制备流程
扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--

 需要冷冻流程还是固定流程? 兔子关节软骨组织

扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--

 扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--

 
 

冷冻断口

 

 

 

 

 

 

化学固定断口,液氮脆断。

 

 

 

Specimen Preparation Procedures  样品制备规程
?What do think you need to know?  需要知道考虑什么问题?
?Discuss with microscopist(s) !  和显微镜工作者讨论
?Choose possible approach(es)  选择可能的途径
?Experiment   实验
?Choose final approach(es)  选择最终的方法
?Interpret results   说明实验结果

Why Not Freeze Always?   为什么不总是冷冻观察?
?Possible artefact formation  可能的人为假象
?Rapid freezing not possible  不可能快速冷冻
?Comparison to published work  和已经发表的作品比较
?Not always correct!   不总是正确的
?Access to fresh tissue not possible 不可能接近新鲜组织……etc.  等等

Chemical Fixation  化学固定
?The composition of a fixative  固定剂的成分
?Fixing agent(s)  固定剂
?Vehicle (buffer, ions etc.) 媒介(缓冲,离子等等)
?Fixation conditions  固定条件
?Time; Temperature; pH  时间,温度,PH值
?Dehydration     脱水
?Drying methods  干燥方法

The Fixing Agent  固定剂
?Macromolecule cross-linker 高分子交联剂
?Kill cells   杀死细胞
?Possible provider of contrast  提供可能的反差
?Will create artefacts   将产生人为因素
?Several often used together  经常几种共用

The Aldehydes    醛类
? Glutaraldehyde  戊二醛
? Popular since 1960s – slow penetrating   1960年代开始流行,-缓慢渗透
? Needs oxygen  需要氧气
? Formaldehyde  甲醛
? Used in combination with glutaraldehyde  和戊二醛联合使用
? Faster penetration BUT unstable  快速渗透,但不稳定
? Potentially least disruptive  潜在的少量破裂
? Acrolein (acrylic aldehyde)  丙烯醛
? Highly reactive and fast penetration  高度反应,快速渗透
?All crosslink proteins  所有的铰链蛋白
?All remove basic groups  清除集群碱基

Osmium Tetroxide 四氧化锇
?Cross linker mainly of unsaturated lipids, 不饱和脂类为主的交联剂
some proteins & phenolic compounds 一些蛋白质和酚类化合物
?Main use in secondary fixatives 主要用于第二固定剂
?Causes elastic electron scattering (BSE)  促成弹性散射(背散射电子增加)
?Can solubilise some proteins 可溶解一些蛋白质

Effects of Fixing Agents  固定剂的影响
?Main reaction = proteins  主要作用--蛋白质
?Some with lipids (fats)  一些和脂类
?Rarely with carbohydrates 很少影响糖类
?Reduction in pH (Buffer)  降低缓冲区的PH
?Cell death = acidification  细胞死亡--酸化
?Acidification
?Solubilisation/extraction (cations)  溶液抽取阳离子

?Artefacts  人为假象

Specimen Dehydration 样品脱水
2 Major Steps: 主要两步
?1. Water replaced by organic solvents: 用有机溶剂置换水分
?2. Remove organic fluids: 去除有机流体
?by Critical Point Drying (CPD)  使用临界点干燥器
?By ‘air drying’  空气干燥   tissue distortion  组织变形
?by sublimation (freeze drying)  冷冻干燥(升华)

扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--
Critical Point Drying   临界点干燥
?Normal shrinkage 10-15%.  正常收缩 10-15%
?Embryonic tissue can shrink by >60%.  胚胎型组织可以收缩到60%
?CPD causes selective solubilisation  临界点干燥导致选择性的溶液化
?supercritical CO2 used to decaffinate coffee
?With careful use it can give good results 小心操作可以得到好的结果
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Cryotechniques: Why ? 冷冻技术,为什么?
? Drawbacks of chemical fixation  化学固定的缺点
? Only method suitable 唯一适合的方法
? Arrest metabolic or contractile processes   阻止新陈代谢和收缩过程
? Immunocytochemistry   免疫细胞化学
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 Avoid Crystallisation  避免结晶作用
? Rapid removal of heat  快速消除热量
– latent heat of fusion removed faster than it is released 消除溶解潜热的速度比释放的速度更快
? Virtually impossible with pure water  几乎不可能使用纯水
? Possible in biological tissue
– Cryo-protectants (e.g. glycerol, methanol)
– Rapid freezing
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 Cooling Methods
? Liquid Nitrogen
– Leidenfrost effect
? Nitrogen Slush
? Intermediate liquid
– Propane, Freons, Iso-pentane
– Immersion or spraying
? ‘Slam’ freezing
? High Pressure
– Special apparatus
Conclusions
? Optimising freezing is possible
? Smaller samples are easier
? Many approaches possible
? Experimentation necessary
? Artefacts can form
? Care with cryogens
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 Conclusions - Freezing
? Can be better than fixation
? Artefacts are formed
? Care required with interpretation
? Cryogens can be dangerous
? Only choice for some tissues
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扫描电镜应用之:生命组织和生物材料的样品准备 - 驰奔 - --COXEM有限公司 中国代表处--
 
 Sample Coating
?Almost all biological samples
?Oxidising metals
?Polymers or ceramics
Sample Coating(Sputtering)
?SE very sensitive to specimen charge
?Large number of SE (e.g. Au, Pt, Pd)
?Distributes effects of heating
?Deposited as granules (hi res problem)
?May interfere with X-ray and BSE emission
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 Potential SEM Information
? If used incorrectly
– Very little
– Waste of time and effort
? If used to its potential
– Much
– Dependent upon
? Specimen preparation
? Imaging conditions
? Interpretation and analysis
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